PCR引物设计的基本思路

根据PCR实验需要，确定需要扩增的DNA序列，并知道其CDS区序列（编码结构基因区,即从起始密码子区至终止密码子区） ncbi网站查询
 

 RBS             149..153

 1 ggatcccgat cgtgtcggag gaagaggcca agtcgcgccg ccccgaccag ctgctggtgc

 

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2.选择所需的载体,确定合适的酶切位点。

所选择的酶切位点尽量为多克隆位点的中间酶切位点，且载体上其它地方无该酶切位点。这样连接以后再构建新的质粒时选择酶的空间更大些。并保证所需扩增的DNA序列中无该酶切位点（generuner分析）。

3.初步确定设计的引物长度。

 一般为15～30bp，引物过短会影响到扩增的特异性，过长会影响扩增速率。如果扩增产物≤500bp，引物长度为16～18bp即可。若扩增产物为4～5kb，引物最好不要少于24bp。引物3’末端应含有所研究基因特异序列中的17～30bp。

4. 正向引物的设计：

4.1 酶切位点的位置选择。一般情况下都需要在引物的5’，3’端增加酶切位点，然后利用该酶将扩增产物切下，接到相应的载体上。

A：扩增的DNA用于表达时：

自身有启动子。如：

LOCUS       VITVHBA                  689 bp    DNA     linear   BCT 26-APR-1993

DEFINITION Vitreoscilla sp. hemoglobin (VHb) gene, partial cds.

ACCESSION   M30794 M31721 X13516

VERSION     M30794.1 GI:155319

KEYWORDS    hemoglobin; promoter region.

SOURCE      Vitreoscilla sp.

 ORGANISM Vitreoscilla sp.

REFERENCE   1 (bases 42 to 689)

 AUTHORS   Khosla,C. and Bailey,J.E.

 TITLE     The Vitreoscilla hemoglobin gene: molecular cloning, nucleotide

 JOURNAL   Mol. Gen. Genet. 214 (1), 158-161 (1988)

 MEDLINE   89143453

REFERENCE   2 (bases 1 to 210)

 AUTHORS   Khosla,C. and Bailey,J.E.

 TITLE     Characterization of the oxygen-dependent promoter of the

 JOURNAL   J. Bacteriol. 171, 5995-6004 (1989)

COMMENT     Original source text: Vitreoscilla sp. DNA.

FEATURES             Location/Qualifiers

    -10_signal      73..79

ORIGIN     

扩增片段里应包含启动子，所以酶切位点应该在启动子前面。

可在所扩增的DNA序列的启动子前寻找是否有该酶切位点，若有则直接利用该酶切位点进行扩增；若无可寻找与其基本相似的位点进行扩增。

（2）扩增片段里自身无启动子。

因为在5’端增加的酶切位点（所选的酶切位点与启动子的酶切位点相同）中必须含起始密码子，如NcoI（CCATGG），Nde I(CATATG),设计引物时，酶切位点的起始密码子要和DNA序列的起始密码子重叠.如上例：若添加的酶切位点为NdeI，引物的5’端酶切位点应设计位5’—CATATGTTAGAC—3’;若添加的酶切位点为NcoI,因为其位点ATG后的G与DNA起始密码子后的T不配对，在处理这个问题上有两种方法：一种是用G取代T,其缺点是破坏了阅读框，可能对表达会有影响；另外一种方法是将酶切位点上的G改为T,相应的酶切位点应改为ACATGT,并查询是否有该酶存在,若有，可以直接利用，因为同尾酶也可连接。若无，可用平末端连接。

B：若扩增的DNA用于阻断.如eryF:

 1 ggatcccgat cgtgtcggag gaagaggcca agtcgcgccg ccccgaccag ctgctggtgc

 因为只需要扩增出一定长度的与染色体DNA同源的序列就可以，所以对酶切位点的位置无特殊要求。只需要寻找与所需扩增的DNA配对较好的区域作为酶切位点就行。如上，可选择ggatcc.

4．2克隆PCR产物的方法之一，是在PCR产物两端设计一定的限制酶切位点，经酶切克隆到用相同酶切的载体上。但实验证明，大多数限制酶对裸露的酶切位点不能切断。必须在酶切位点旁边加上一个至几个保护碱基，才能使所定的限制性酶对其识别位点进行有效切断。加的个数见Biolabs242所示，加的种类要和扩增的DNA序列相匹配。如NdeI,Biolabs显示在其酶切位点上加4个核苷酸时，酶切2小时，酶切效率达到50%，而加1个核苷酸时，酶切20小时酶切效率仍然为0%，所以应在酶切位点前加4个核苷酸；为了达到尽可能与需要的DNA配对，所以应选gaac;

4.3 在所添加的酶切位点后加17-30个与扩增的DNA配对的核苷酸序列。

结合以上几点，对于vhb基因5’端引物可以为5’---gaac CATATG ttagac cagcaaacca ttaacatc—3'。

对于eryF基因可设计为5’--nnnggatcccgat cgtgtcggag gaag—3’

4不同细胞对密码子的使用频率各不相同，密码子的使用频率与细胞内相应tRNA的丰富是一致的，密码子使用频率高意味着需要较多的相应tRNA，二者之间的相互协调有利于细胞内一些含量高的蛋白质的顺畅表达。同理，当人们期望人工合成的基因能在细胞内高效表达，也要选择该细胞偏好的密码子作为基因的密码子，这样可以充分利用细胞内丰富度高的tRNA，使基因得到高效表达。所以对引物起始密码子以后的几个密码子要根据密码子的简并性进行改变。大肠杆菌基因密码子的使用情况：原核生物的代表大肠杆菌基因的研究开展最早，进展也最快。比较了大肠杆菌中13种含量较多的蛋白质的密码子使用情况发现这些高度表达的基因中密码子的使用有以下规律：对于以C或U结尾的同义密码子，如前两个碱基为A、U，则第三个碱基优先使用C；前两个碱基为C、G，则第三个碱基优先使用U。这样的选择有利于在翻译时密码子与反密码子相互作用，两者的作用能不太强也不太弱，而一中度为宜即所谓最适相互作用能。

 

 

5.反向引物的设计

表达时，要考虑终止密码子的位置，所扩增的片段里必须包括终止密码子 ，所以酶切位点应该在终止密码子后寻找。酶切位点的选择原理与5’端一样。

扩增的DNA用于阻断。与表达时相同，只是无需过于要求酶切位点的位置。

6.应注意碱基分布的均衡性。引物应避免嘌呤或嘧啶的堆积现象，避免连续出现4个以上的同一碱基。

7.检查两条引物是否存在二级结构或二聚体。（dnaman分析）如上，VHB ggatcccgat cgtgtcggag gaag；

Two primers complementarity.

Max complementarity in continuous: 4 bp, free energy=-1.60 Kcal/mol

3'-GGCTGGTGTATCCTGTCGCCTAGGTG-5'

Max complementarity in discontinuous: 9 bp

5'-CCCTGCAGCAGTCGCTGGGTGAG-3'

 3'-GGCTGGTGTATCCTGTCGCCTAGGTG-5'

8.计算Tm值。

一般退火温度为55℃～60℃，而Tm值比退火温度高5～15℃。两条引物的Tm值最好相同，相差不要超过3℃。

9.特异性分析。必须保证酶切位点后的特异性序列在已知的序列中不存在，否则会出现非特异性条带。

EryF引物

正向:

 5’-AAGGATCCAAGTCGCGCCGCCC-3’

反向:

 5’-CAAGGATCCCATGCTGTGCCCGAA –3’

 

PCR反应量的选择：

要扩增的是总DNA，在PCR反应前应预先变性总DNA（即100℃水浴中煮沸5～10min）

酶的选择

对于扩增高GC的片段，应使用LA Taq 酶，缓冲液也应该用GC Buffer.

3. 酶量的选择

酶量过多时易发生非特异性反应；而酶量过少时，反应性能下降。一般50ul的体系可使用2.5U的酶（即5U/ul,加0.5ul）

模板DNA的用量

总DNA为0.1～1 ug；片段DNA为0.1～10ng。

引物用量

终浓度为0.1～1.0uM。引物浓度太低时，有时扩增产物太少；引物浓度太高时，比较容易出现非特异性扩增反应。通常模板DNA的量较多或High complexity DNA(如总DNA)作模板时，引物浓度应该低一些；当模板DNA的量较少或Low complexity DNA（如plasmid等）作模板时，引物浓度应高一些。

 ddH2O              9.5ul

 2×Gcbuffer        25ul 用量参考TaKaRa目录

 dNTP               8ul

 Primer 1 0.5ul (稀释后的浓度为25uM,终浓度0.25umol/L)

 Primer 2 0.5ul(终浓度0.25umol/L)

 LA Taq 0.5ul(产品浓度为5U/ul)

 总DNA 6ul(浓度是0.05 ug/ul,质量为0.3ug)

 50ul体系

PCR反应

PCR的反应液应在冰中调制，然后安置于PCR反应仪上进行PCR反应。这种冷启动法可增强PCR反应的特异性，减少PCR反应中的非特异性带，能得到良好的PCR反应结果。

PCR反应条件的选择

变性时间、温度及延伸温度基本固定

退火温度一般为55～60℃，对于GC%小于50%，一般用55℃；GC%≥50%时一般用60℃。退火温度太高会得不到扩增产物；太低时容易发生非特异性反应。若此时有非特异性带，可提高退火温度，但不应高于68℃，因为合适的退火温度应在45～68℃之间。

退火时间：一般以每Kb设定在30s～1min 。

延伸时间：延伸时间太短时，会的不到扩增产物或者会有一些短的非特异性产物优先生成；而太长时，会出现涂布现象。一般扩增片段≤500bp,采用1 min ;大于500bp时，采用3min。

95℃ 5min

94℃ 1.5min

65℃ 30s         ×30

72℃ 2min

72℃ 7min

 

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提示：本文PCR引物设计基本思路属于引物设计文章，主要介绍引物设计、PCR引物设计方面的知识，内容仅供学习交流与参考，不代表创博环球（北京）生物科技有限公司的观点。