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蛋白质磷酸化Western Blot修饰研究的新方法

Introduction

蛋白质磷酸化对于许多生物现象的引发是很必要的，包括细胞生长、增殖、泛素（ubiquitin）介导的蛋白降解等过程。特别是酪氨酸磷酸化，作为细胞信号转导和酶活性调控的一种主要方式，通常通过引发蛋白质之间的相互作用，进而介导生长因子、荷尔蒙和细胞因子等对细胞膜上受体的信号调控。

然而，酪氨酸磷酸化在细胞的所有磷酸化修饰中所占的比例却非常低。大概10%的细胞蛋白会受到磷酸化共价修饰，但每100次蛋白的磷酸化修饰中仅有1次酪氨酸基团的修饰。与大部分细胞中的丝氨酸和苏氨酸磷酸化水平相比，酪氨酸磷酸化的水平估计要低2000倍。正是由于细胞中酪氨酸磷酸化的水平相当低，才能保证细胞在内外信号的刺激下，作出灵敏的反应，所以研究酪氨酸的磷酸化对于细胞信号的调控和许多重要生物现象的研究具有极为重要的意义，而对发生酪氨酸磷酸化的蛋白质的识别及磷酸化位点的鉴定对揭示细胞过程的调控和药物的作用位点起到非常重要的作用。研究蛋白质磷酸化的相关方法：

磷酸化Western Blot：

对于信号转导科研来说，抗酪氨酸磷酸化抗体的出现是一个意义重大的事件。在没有抗酪氨酸磷酸化抗体之前，蛋白质和酶的酪氨酸磷酸化只能通过非常危险的并且很费时的放射性实验来检测。而利用抗酪氨酸磷酸化抗体，则可以通过Western Blot或其它免疫学方法轻松地检测到磷酸化信号。常规的检测方法包括：用抗酪氨酸磷酸化抗体在Western Blot上检测内源或外源表达的磷酸化蛋白。如果目标蛋白的含量较低，也可利用免疫沉淀的方法先富集发生磷酸化的酪氨酸蛋白，再检测目标蛋白的水平。抗酪氨酸磷酸化抗体也常用于检测在不同处理的条件下，细胞内总的酪氨酸磷酸化水平的变化情况，作为许多细胞生物现象的一个重要指标。

我们都知道如果需要检测某一个目标蛋白的某一特定位点的磷酸化状态，可以选用该蛋白特定位点的磷酸化特异性抗体。但由于我们研究的通常是新的磷酸化位点，或者这些蛋白特定位点的磷酸化抗体效果不够好，我们不得不自己制备磷酸化抗体。如果大家自己制备过磷酸化抗体，就会知道磷酸化抗体的制备比一般抗体的制备更加困难，而且浪费大量宝贵时间。现在国外的科学家发现可以使用通用型的磷酸化抗体，只要巧妙的设计实验，也可以达到同样的检测目的。以Yuan的文章为例，他们需要检测BCR-ABL的磷酸化，但他们没有特异性的磷酸化抗体。他们首先使用了抗c-ABL的抗体和蛋白G-琼脂糖珠子来免疫沉淀富集BCR-ABL蛋白，然后再通过Western-Blot和4G10通用型酪氨酸磷酸化抗体（pan-phosphotyrosine）来鉴定BCR-ABL蛋白的酪氨酸磷酸化水平。另外一组以Clemens为首的科学家，则利用抗Dock蛋白抗体先免疫共沉淀了DACK蛋白，再用4G10酪氨酸磷酸化抗体来检测DACK蛋白和DSH3PX1蛋白的酪氨酸磷酸化水平，通过区分这些蛋白的分子量大小，来确认相应的磷酸化条带的蛋白身份。

与做普通的Western Blot相比，磷酸化Western Blot有一些要额外需要注意的事项：

首先，由于蛋白的磷酸化是可逆的，会被磷酸酶去磷酸化，所以在样品制备和整个免疫检测过程中，需要抑制或避免细胞内源性和外源性的磷酸酶的干扰。针对细胞内源性的磷酸酶，我们在样品制备时，需要在细胞裂解液中加入足量的并且是新鲜的磷酸酶抑制剂，如PhosphoSafe 系列。外源性的磷酸酶主要是由实验过程中的其它试剂带入的，比如我们要确保封闭剂中不含磷酸酶等。同时，样品中或其它试剂中带的细菌也会分泌外源性的磷酸酶，所以做磷酸化Western Blot的另一个关键是要尽量使用清洁的新鲜的溶液和新做的SDS聚丙烯酰胺凝胶，并且最好在样品制备完就立刻上样，当天完成SDS-PAGE和Western Blot 检测。如果要使用同一块Blot进行全蛋白的免疫检测，就需要先做磷酸化的检测再做全蛋白的检测，以尽量避免磷酸化信号的丢失，这点非常重要。

有一些实验是用Western Blot来验证一组磷酸化的多肽或蛋白的存在，这时候就需要使用的通用型磷酸化抗体。因为通用型磷酸化抗体，如4G10酪氨酸磷酸化抗体，具有广泛的识别范围，同时具有很好的磷酸化特异性，才不会导致假阴性结果的产生。

以Liu的研究为例，他们就使用了通用型的抗酪氨酸磷酸化抗体4G10和PY20，利用Western Blot技术来验证其通过多肽芯片筛选出的多肽结果。他们的实验室是这样设计的，首先利用磷酸化酪氨酸的多肽芯片（phospho-tyrosine peptide array）来筛选与SH2结构域结合的磷酸化多肽序列，然后对这些合成的多肽序列进行Western Blot验证，利用通用型的抗酪氨酸磷酸化抗体4G10和PY20检测其磷酸化水平。他们发现不同的抗体具有很不一样的识别特异性，如pTyr-Pro 序列能被某些SH2结构域结合，而不被4G10和PY20识别。但就总体而言，通用型的抗酪氨酸磷酸化抗体可以识别绝大多数的SH2结构域结合的磷酸化多肽，特别是4G10抗体比PY20抗体能识别更多的磷酸化酪氨酸多肽。

磷酸化蛋白质组学（PhosphoProteomics）：
磷酸化蛋白质组学与蛋白质组学类似，可以通过2D胶和质谱MS鉴定出新的磷酸化蛋白和蛋白的新磷酸化位点。但是利用MS从磷酸化蛋白中检测出磷酸化肽段会遇到许多问题，这是由于样品中大量的非磷酸化肽段的存在使磷酸化肽段的相对浓度降低造成的。大量的非磷酸化肽段会抑制MS对磷酸化肽段的检测，因此必须采取额外的实验步骤在MS之前富集磷酸化蛋白或磷酸化肽段。对此，抗磷酸化特异性抗体以及亲和层析琼脂糖珠子或柱子就能起到很好得到富集作用。特别是对于细胞中比例很低的酪氨酸磷酸化的研究来说，富集的过程尤显重要。目前，通用型的抗酪氨酸磷酸化（pan-phosphotyrosine）单克隆抗体4G10和PY20已被证明对寻找蛋白酪氨酸磷酸化位点起到很好的作用。除此以外，也有一些通用型的抗丝氨酸和苏氨酸磷酸化的抗体如4A4，也可用于MS之前富集丝氨酸和苏氨酸磷酸化的蛋白。

Guha研究组就是利用这种方法来研究EGFR和KRAS的磷酸化水平变化的。

在肺腺癌（lung adenocarcinoma）病人中，原癌基因EGFR和KRAS是两个最经常发生突变的基因。但是带有EGFR不同的突变或带有KRAS的突变的病人，对TKI治疗法（酪氨酸激酶抑制剂治疗法）有不同的治疗效果。Guha等人通过磷酸化蛋白质组学的方法来比较带这些不同突变的病人的磷酸化蛋白的情况，揭示这些突变的细胞内EGFR和KRAS的下游信号通路的变化，从而揭示了解造成TKI治疗不敏感的机理。

首先，Guha等人使用了偶联了抗酪氨酸磷酸化抗体的琼脂糖珠子（4G10-agarose），对带有不同突变的细胞裂解液进行免疫沉淀。通过这一步，可以对发生酪氨酸磷酸化的蛋白以及与这些磷酸化蛋白紧密结合的其它蛋白进行有效的富集。免疫沉淀的蛋白可以被100mM的磷酸苯酯洗脱出来，然后进行透析，为下一步跑胶做去除过多的盐分和离子的准备。其实，透析很费时间，而且蛋白样品甚至会被稀释，可以选择使用超滤离心（Amicon Ultra）的方法用半小时就可去除离子同时浓缩样品。接下来，处理好的磷酸化蛋白样品通过SDS-PAGE 胶分开后，进行质谱分析前的常规处理，包括使用Coomassie 染料进行染色，把胶切成20-30块小块，胰酶消化成多肽片段等。通过LC-MS\MS，即可定性和定量的分析发生酪氨酸磷酸化的蛋白以及与这些磷酸化蛋白紧密结合的其它蛋白。已被鉴别出的这些蛋白，可以用Western blot的方法，并结合使用特异性蛋白抗体和4G10抗体，对这些蛋白的酪氨酸磷酸化状态进行进一步确认。

Lind等人的研究也利用了类似的方法，在做质谱分析之前，使用通用型的抗酪氨酸磷酸化抗体来富集磷酸化蛋白或肽段。有趣的是，他们与前面提到的Liu的文章有一致的发现，在文中使用的5种酪氨酸磷酸化抗体中，使用4G10抗体富集的MS结果最后识别了最多的潜在酪氨酸磷酸化蛋白。

除了这种磷酸化蛋白质组学的通用方法以外，现在也出现了创新的方法来帮助研究磷酸化蛋白质组学。其中基于Luminex xMAP和Epitome的Epiquant技术，就实现了对多种蛋白的磷酸化和同一蛋白上的多个磷酸化位点以及全蛋白，同时进行高通量地定量检测。考虑到同时检测同一个细胞上，同一条Pathway上、下游蛋白的协同作用，可使用流式细胞术进行研究。

蛋白酪氨酸激酶（PTK）活性分析：

酪氨酸磷酸化由蛋白酪氨酸激酶（PTK）诱导。PTK有很多的种类，包括跨膜的和细胞质内可溶性的酶。PTK在多种细胞过程中发挥了极其重要的作用，其中包括细胞生长、分化和新陈代谢等。许多疾病也与某些PTK失调密切相关，比如造血系统的恶性肿瘤、肾细胞癌、甲状腺癌等多种癌症以及糖尿病、类风湿性关节炎等等。因此，对于PTK的活性分析也是细胞调控研究和药物研发中常常需要进行的研究。通过PTK的活性分析可以筛选PTK抑制剂，并可以获得这些抑制剂的IC50参数。

PTK的活性分析最传统的方法就是使用同位素的PTK的活性分析，后来也有多种非放射性的较安全的分析方法，例如，有基于ELISA的PTK活性分析，其中应用了可以被许多PTK磷酸化的随机多肽序列和HRP偶联的抗酪氨酸磷酸化的特异性抗体。也有基于竞争性结合的荧光偏振的分析方法。现在，更有基于HTRF (homogenous time-resolved fluorescence) 的全新的PTK活性分析方法。这种方法利用了荧光共振能量转移（FRET）的原理，比基于ELISA和基于荧光偏振的方法更灵敏，信号也更稳定，对于需要一段时间孵育的激酶分析来说会更有优势。以通用型的4G10 HTRF分析为例，它使用了偶联于Europium的工业化标准单克隆抗体4G10，生物素标记的酪氨酸多肽底物，和APC标记的链霉素等。只要在体系中加入PTK激酶后，若多肽底物发生磷酸化，则此底物能被4G10抗体结合，导致荧光染料APC和Europium的距离很近足以发生荧光共振能量转移，激酶的活性越强则HTRF信号的加强越显著（实验原理见下图）